Вступ. Глобальне поширення в світі в наш час резистентних до антимікробних препаратів (АМП) штамів мікроорганізмів значно знижує ефективність лікування інфекційних захворювань. Визначення антимікробної резистентності (АМР) та інтерпретація отриманих результатів в країнах Європи вже майже декілька десятків років проводиться згідно рекомендацій EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Впровадження єдиних Європейських стандартів в Україні розглядається як частина Національного плану дій щодо боротьби з АМР [1]. Однак стандартні диско-дифузійні методи з визначення чутливості потребують часу (з урахуванням виділення чистих культур - 48 – 72 години), а для раціонального лікування важлива невідкладна цілеспрямована протимікробна терапія. Актуальним є впровадження швидких технологій дослідження чутливості бактерій до АМП.
Мета роботи: ознайомлення з експрес-технологіями визначення чутливості мікроорганізмів до АМП та порівняння їх ефективності.
Матеріали і методи. Проводили пошук, аналіз та узагальнення даних, викладених у наукових публікаціях щодо проблеми АМР, методів експрес-виявлення чутливості мікроорганізмів до АМП.
Результати та обговорення. Основні сучасні експрес-технології виявлення чутливості - автоматизовані методи з використанням біохімічних та спектрометричних маркерів, матрично-активована лазерна десорбція/іонізація з прольотною мас-спектрометрією (MALDI-TOF MS), молекулярні тести на основі гібридизації та ампліфікації нуклеїнових кислот [2].
На автоматизованих методах ідентифікації бактерій на основі детекції біохімічних хромогенних та флуорогенних субстратів та визначення АМР на основі мінімальних інгібуючих концентрацій (МІК) АБП базуються широко відомі мікробіологічні аналізатори Vitek2, Microscan, Sensititre, BD Phoenix. На цих аналізаторах можлива ідентифікація клінічно значущих мікроорганізмів - ентеробактерій, стафілококів, стрептококів, псевдомонад, ацінетобактерів, нейссерій, гемофілів, анаеробних збудників. Також використовуються картки чи планшети для визначення чутливості з проведенням фотометричної оцінки каламутності та окисно-відновного потенціалу - визначається від 5 до 7 МІК до 19-25 АБП. Аналізатори з використанням фенотипових методів здатні виявляти наявність β-лактамаз розширеного спектру у панелях для грамнегативних бактерій визначенням чутливості до цефалоспоринів третього покоління в присутності та за відсутності клавуланової кислоти та виявляти продуцентів карбапенемаз за визначенням чутливості до іміпенему/меропенему. Також проводиться виявлення пеніциліназ стафілококів у нітроцефіновому тесті, визначення метицилін-резистентності у S. aureus скринінгом з цефокситином/оксациліном та ванкоміцин/тейкопланін-резистентних S. aureus та Enterococcus spp. Дослідження включає 3 етапи: виділення чистої культури, приготування інокулюму та внесення в апарат, після чого аналізатор сам виконує заповнення карток/планшетів мікробною суспензією, інкубацію, зчитування, обробку даних, видачу результатів протягом 4-9 годин [3].
MALDI-TOF MS є однією з найсучасніших систем експрес-ідентифікації мікроорганізмів та визначення чутливості. Цей метод включає прямий мас-спектрометричний аналіз білкової фракції мікробних клітин (переважно рибосомальних білків, які є консервативними в межах виду). Готується слайд з біологічного матеріалу (колонії чистої культури чи бульйонної гемокультури), який поміщають у вакуумне середовище і наносекундний лазерний імпульс іонізує матрицю із зразком. Під дією електричного поля іонізовані білки рухаються до детектора з прискоренням, обернено пропорційно до їх атомних мас. Програмне забезпечення приладу оцінює час прольоту частин і перетворює цю інформацію на спектр молекулярних мас (мас-спектр). Мас-спектр порівнюється зі спектрами з бази даних та відбувається ідентифікація мікроорганізмів. Для визначення чутливості культуру збудника в автоматичному режимі інкубують з різними АБП і оцінюють результат за інтенсивністю характерних спектральних піків [4]. Однак є й слабкі сторони методу: деякі мікроорганізми (певні види мікобактерій, ацінетобактерів, коринебактерій та β-гемолітичних стрептококів) не завжди можуть бути ідентифіковані - це пов'язано з їх генетичною спорідненістю. Також, мікроорганізми, що утворюють капсули (S. pneumoniae, H. influenzae та K. pneumoniae) стійкіші до лізису клітин і це може призвести до більш низької екстракції, до менш якісних спектрів і, таким чином, до помилкової ідентифікації. Внаслідок цих можливих помилок рекомендовано проводити випробування у двох повторах та усереднювати спектральний результат [5]. Час дослідження MALDI-TOF MS складає 6-10 хвилин. Для випробування потрібна мінімальна кількість витратних матеріалів. Купівля самої системи пов'язана із відносно високими витратами, проте експлуатаційні витрати низькі. Два основні прилади для мікробіологічної MALDI-TOF MS - Vitek MS (ВioMеrieux) та MALDI Biotype (Bruker Daltonics).
Молекулярні технології виявлення генів або мутації, що призводять до виникнення резистентності збудників, базуються на різних форматах ПЛР-ампліфікації або гібридізації з ДНК/РНК-зондами. Ці методи є важливими для визначення карбапенемаз у P. aeruginosa та Acinetobacter spp., β-лактамаз розширеного спектру у Enterobacterales, резистентності до поліміксинів у грамнегативних бактерій, mecA/mecC-опосередкованої резистентності до β-лактамів у S. aureus, vanA/vanB-опосередкованої резистентності до глікопептидів у E. faecium та E. faecalis. Можливо використання як чистої культури так і біологічного матеріалу, а час визначення складає декілька годин [6]. Технологія PNA-FISH використовує зонди пептидо-нуклеїнової кислоти, які забезпечують більш швидке та специфічне зв’язування в порівнянні з традиційними зондами. В комерційній технології QuickFish (OpGen, США) цей метод дозволяє проводити ідентифікацію збудника шляхом аналізу 16S рРНК. Технологія XpressFish специфічно виявляє ген mecA у Staphylococcus, що в комплексі з QuickFish дозволяє визначити АМР в позитивній культурі крові вже через 2 години. Найсучасніша унікальна молекулярна технологія PCR-ESI-TOF (IRIDICA, ABBOTT) є поєднанням ПЛР з часопролітною мас-спектрометрією і забезпечує можливість скринінгу всіх присутніх у зразку патогенних мікроорганізмів (бактерій, вірусів, грибів, найпростіших) без попереднього культивування. Хоча висока коштовність цієї технології є перешкодою до її широкого застосування, сучасні мультиплексні методи є високо перспективними, особливо у складі синдромних платформ для діагностики інфекцій респіраторних шляхів або кровотоку. Інноваційні методи DOT-MGA дозволяють виявляти АМР бактерій, інкубованих з граничними концентраціями антибіотиків безпосередньо на пластині-мішені MALDI-TOF MS, шляхом визначення продуктів генів резистентності [7].
Висновки. Експрес-діагностика визначення чутливості мікроорганізмів до АБП є вкрай актуальною для раціональної терапії та стримування розвитку АМР. Оптимальними в умовах нашої країни для крупних лікарень та лабораторних центрів залишаються автоматизовані прилади для визначення чутливості з використанням спектрофотометрії, які значно скорочують та спрощують дослідження і доступні по коштовності. Генотипова ідентифікація маркерів резистентності є додатковою в певних випадках (для визначення стійкості до поліміксину, β-лактамів, глікопептидів). MALDI-TOF MS – найсучасніший швидкий метод експрес-ідентифікації мікроорганізмів та визначення чутливості, який потребує мінімальну кількість витратних матеріалів і є вкрай перспективним, але з-за високої коштовності приладів поки що малодоступний в Україні.
Список літератури:
1. Antimicrobial resistance. Center of Public Health of the Ministry of Health of Ukraine. https://www.youtube.com/playlist?list=PLiUQ4J0vu34p6a0gc-kxUfeM74R8sqO36
2. Vasala A. Modern Tools for Rapid Diagnostics of Antimicrobial Resistanse. Front Cell infect Microbiology. 2020.15.10.308. doi: 10.3389/fcimb.2020.00308
3. Zeitler, K, Narayanan, N. The Present and Future State of Antimicrobial Stewardship and Rapid Diagnostic Testing. Curr Treat Options Infect Dis 11, 177-187 (2019). https://doi.org/10.1007/s40506-019-00190-9
4. UK Standards for Microbiology Investigations: MALDI-TOF MS Test Procedure, Standards Unit, Microbiology Services, Public Health England, UK, 2015
5. Clark AE, Kaleta EJ, Arora A, Wolk DM. (2018) Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry: a fundamental shift in the routine practice of clinical microbiology. Clin Microbiol Rev., 26:547 -603
6. Duda О К, Gorbal N B, Masalitina ОV. The role of beta-lactamases in the formation of antibiotic resistance. Liku Ukrainu, 2015. №5 (191). С. 7-11.
7. Sunsfjord A, Simonsen GS, Haldorsen BC. Genetic methods for detection of antimicrobial resisten. APMIS.2022. 112 (11-12):815-37.
|
Голосування 
Ця робота ліцензується відповідно до Creative Commons Attribution 4.0 International License
Знайшли помилку? Виділіть помилковий текст мишкою і натисніть Ctrl + Enter